Papel del biofilm en la otitis canina

Introducción

La otitis es una afección frecuente en la clínica veterinaria generalista, siendo las alergias la principal causa desencadenante de la otitis canina. La inflamación del conducto auditivo puede dar lugar a un sobrecrecimiento secundario de bacterias o levaduras y, si no se trata, la otitis puede convertirse en crónica. En estos casos, pueden entrar en juego factores perpetuantes como la otitis media, la calcificación del conducto auditivo externo o la alteración de la flora microbiana del oído con la consecuente aparición de cepas bacterianas más virulentas 1.

En algunos casos, especialmente cuando están implicados determinados patógenos como Pseudomonas spp., se puede observar la formación de biopelículas o biofilm 1. El biofilm es una biomasa compleja y viva con una estructura específica que hace que, una vez establecida, su eliminación sea muy complicada. Los microorganismos del biofilm utilizan diversos elementos para volverse más resistentes tanto frente al sistema inmunitario del huésped como al tratamiento antibiótico 2. El objetivo de este artículo es aclarar el concepto de biofilm, proporcionando la información necesaria para reconocer su presencia, lo que facilitará la implementación de estrategias terapéuticas adecuadas.

Lo que se esconde: desentrañando el misterio del biofilm

El biofilm es una estructura compleja formada por la acumulación de microorganismos que crean un agregado bacteriano de composición única. El biofilm está formado predominantemente por agua (90%), mientras que el 10% restante lo constituye la biomasa microbiana 2. Los principales componentes de la matriz del biofilm, además de agua, son exopolisacáridos (EPS), ADN y proteínas. Esta combinación de componentes confiere importantes propiedades al biofilm que afectan a la supervivencia y persistencia de las bacterias integrantes 3.

El desarrollo de la estructura tridimensional del biofilm tiene lugar en varias etapas. El proceso se inicia con la fijación o adhesión de bacterias en estado libre, conocidas como planctónicas, a una superficie. Esta adhesión se vuelve irreversible y las bacterias pasan a un estado sésil. Posteriormente, se agregan para formar una microcolonia e inician la producción de la matriz extracelular mediante la activación de genes específicos. Tras la maduración del biofilm, los fragmentos que contienen bacterias planctónicas se desprenden y se dispersan en el medio circundante, facilitando la diseminación del biofilm 2. Una ventaja notable del biofilm es su capacidad de establecer un gradiente desde las capas más externas a las más internas, en términos de nutrientes, cantidad de oxígeno, ritmo de crecimiento y genética 4 (Figura 1).

Uno de los factores clave del biofilm bacteriano es su capacidad para crear una barrera protectora resistente a los antibióticos. Las bacterias integradas en el biofilm se encuentran más protegidas de los efectos antimicrobianos, por lo que las infecciones asociadas al biofilm son más difíciles de erradicar 5. Además, el biofilm es más resistente a las agresiones ambientales, incluyendo los ataques del sistema inmunitario del huésped; por ejemplo, la fagocitosis por parte de leucocitos 6. Otro aspecto crítico del biofilm es su capacidad para transferir genes horizontalmente. Debido a la proximidad de las células bacterianas dentro del biofilm, los intercambios genéticos pueden producirse de forma más eficiente, facilitando la diseminación de rasgos beneficiosos o de resistencia a los antibióticos entre la población bacteriana 7. 

El mecanismo de autoinducción o quorum sensing (capacidad de detectar y responder a la densidad de población celular mediante la regulación genética) desempeña un papel fundamental en el complejo proceso de formación del biofilm. Básicamente, el mecanismo de quorum permite a las bacterias coordinar su comportamiento en función de su densidad celular, pudiendo sincronizar la producción de componentes clave de la matriz extracelular, como los EPS 2.

Formación del biofilm: ¿qué organismos intervienen?

Tanto las bacterias Gram positivas como las Gram negativas tienen la capacidad de formar biofilm. Entre las bacterias implicadas en la formación de biofilm que se han descrito con más frecuencia en las infecciones del oído del perro se encuentran las Pseudomonas spp 8. El biofilm puede estar compuesto por una única especie microbiana o por varias, dando lugar al conocido biofilm polimicrobiano. La diversidad en la composición pone de manifiesto la complejidad de estas estructuras y su papel en diversas infecciones 9.

Otras especies conocidas en medicina humana por la producción de biofilms son Staphylococcus epidermidis, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Streptococcus viridans, Staphylococcus aureus y Enterococcus faecalis 2. En medicina veterinaria, se han observado bacterias formadoras de biofilm, incluyendo Staphylococcus spp. y E. coli en otras localizaciones diferentes a las otitis 10. Además, el concepto de biofilm no se limita únicamente a las bacterias; algunos hongos como Malassezia spp. también tienen la capacidad de formar biofilm 11. Este hecho pone de relieve el significado más amplio del biofilm, abarcando todas las especies microbianas, y destaca la importancia de comprender y manejar el biofilm en diversos contextos de la clínica. También subraya la importancia de no centrarse exclusivamente en Pseudomonas spp. e investigar la posible presencia de otros microorganismos; la identificación de patógenos es esencial para optimizar el manejo eficaz de estas infecciones. El biofilm puede ser una comunidad compleja compuesta por varias especies, por lo que es crucial adoptar un enfoque exhaustivo y polifacético para abordar los diversos retos que puede plantear la identificación de los patógenos responsables.

Para describir la capacidad de formación de biofilm se suele utilizar una escala de débil a fuerte, y dicha capacidad depende de las cepas bacterianas o fúngicas implicadas 12; por ejemplo, en un estudio se ha señalado que Pseudomonas aeruginosa es una fuerte productora de biofilm respecto a otras especies 13. Esta clasificación podría servir como herramienta para valorar la potencial virulencia y resistencia al tratamiento de diversas especies bacterianas, lo que sería útil para la toma de decisiones clínicas, así como para el enfoque terapéutico, pero todavía no se ha investigado el verdadero impacto clínico y terapéutico 12.

Revelación del biofilm: métodos de detección y visualización

Detectar la presencia de biofilm puede ser complicado ya que no suele ser visible a simple vista y se necesitan métodos de detección específicos 14. Clínicamente, el aspecto macroscópico del biofilm puede variar en función de la madurez, microorganismos implicados y región corporal afectada (Figuras 2 y 3). Se pueden observar diferentes características 14:

• Color: puede variar de blanco/translúcido a gris/verde. 
• Textura: puede parecer viscosa, pegajosa o mucoide. 
• Forma: puede presentar un aspecto plano o tridimensional. 

En el caso de infección por Pseudomonas spp. se suele observar clínicamente un biofilm grisáceo/verdoso, pegajoso o viscoso. Esta apariencia se puede atribuir a la presencia de alginato, así como a la producción de piocianina 15.

El aspecto citológico del biofilm depende de los microorganismos involucrados y de la técnica de preparación de la muestra. Se pueden utilizar tinciones especiales para visualizarlo, como la tinción de ácido peryódico de Schiff que evidencia la matriz de polisacáridos, pero estas tinciones no suelen estar disponibles en la clínica veterinaria, lo que dificulta su identificación 16. No obstante, es importante señalar que el biofilm puede observarse como un grupo de células (bacterias, esporas, hifas fúngicas) rodeadas de una matriz extracelular (que no siempre es visible) y pueden ir acompañadas o no de neutrófilos polimorfonucleares o células mononucleares 17 (Figura 4).

Uno de los criterios diagnósticos del biofilm es la identificación en el cultivo bacteriano o fúngico de microorganismos capaces de formar biofilm. Sin embargo, este criterio no se debe considerar como “patrón de oro” en el diagnóstico, ya que se pueden obtener falsos negativos en el cultivo y se han observado diferencias entre el cultivo bacteriano y el perfil de amplicón 16S 18. Los métodos de cultivo tradicionales se basan en facilitar principalmente el crecimiento de bacterias planctónicas, por lo que no imitan con exactitud las condiciones del biofilm. Por lo tanto, el resultado del antibiograma puede no reflejar el verdadero perfil de susceptibilidad antimicrobiana. Además, es complicado reproducir las condiciones del biofilm a partir de cultivos planctónicos debido a las posibles diferencias respecto al estado de maduración de las bacterias del biofilm de la muestra y de las bacterias del cultivo. Las bacterias del biofilm tienen una resistencia a los antibióticos considerablemente mayor que sus homólogas planctónicas, lo que hace que los resultados del antibiograma sean menos predictivos en cuanto a la eficacia del tratamiento 15. 

Esta limitación subraya la necesidad de utilizar métodos alternativos, como la tinción Cristal Violeta utilizando caldos de cultivo (p. ej., Luria-Bertani, Mueller-Hinton o caldo de soja tríptica), para evaluar la producción de biofilm en función de la densidad. Estos métodos ofrecen una comprensión más completa de la presencia de biofilm bacteriano y su posible impacto en los resultados del tratamiento antibiótico 8, pero no se suelen emplear en los cultivos rutinarios. Otros métodos que también son útiles, pero igualmente no se utilizan de forma rutinaria son 19:

• Microscopía electrónica de barrido.
• Microscopía electrónica de transmisión. 
• Microscopía confocal de barrido láser.
• Hibridación fluorescente in situ.
• Biología molecular, como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que detecta genes específicos asociados a la formación de biofilm.

Dada la dificultad de visualizar directamente el biofilm, muchas veces es necesario combinar varios métodos para una identificación precisa y exhaustiva. 

Controlar el biofilm: estrategias eficaces

Como ya se ha mencionado antes, el biofilm confiere a las bacterias una resistencia significativamente mayor a los antibióticos, en muchos casos entre 100 y 1.000 veces superior a la de las bacterias planctónicas 5. Por este motivo es esencial utilizar una estrategia para romper el biofilm y que los tratamientos antibióticos y antifúngicos puedan combatir eficazmente las infecciones bacterianas y fúngicas. El desarrollo de nuevas soluciones para controlar el biofilm no solo supone una mayor eficacia de los antibióticos, sino también la posibilidad de hacer frente a los retos que plantean las bacterias resistentes a los antibióticos. Por lo tanto, cabe realizar una breve revisión de algunos tratamientos que se suelen utilizar como coadyuvantes y que han demostrado ser eficaces frente al biofilm.

La NAC (N-acetilcisteína) es un agente mucolítico que también posee propiedades antimicrobianas. Aunque el mecanismo de acción sobre el biofilm solo se conoce en parte, se ha demostrado que actúa como disolvente del biofilm. En concreto, inhibe la adhesión bacteriana, disminuye la producción de matriz de exopolisacáridos y favorece la disrupción del biofilm maduro rompiendo los enlaces disulfuro de la matriz extracelular. Esto hace que el biofilm sea más permeable y susceptible a los tratamientos antimicrobianos 20. Además, la capacidad de destruir el biofilm se ha demostrado in vitro con especies bacterianas del conducto auditivo externo, concretamente Staphylococcus pseudintermedius y Pseudomonas aeruginosa. Su eficacia varía en función de la concentración de NAC utilizada, recomendándose en torno al 1-2% 13. Es importante destacar que se ha demostrado que la NAC es segura mediante inyección intratimpánica en condiciones experimentales, lo que la convierte en una opción potencialmente no ototóxica y viable para el tratamiento de otitis con secreción crónica 21.

El Tris-EDTA (trometamina-ácido etilendiaminotetraacético) tiene un mecanismo de acción antimicrobiano bien definido. El EDTA actúa como quelante, secuestrando cationes divalentes, lo que a su vez altera la membrana celular externa de las bacterias Gram negativas. Esta alteración provoca la liberación de lipopolisacáridos, haciendo que las células bacterianas sean más permeables a otros antimicrobianos. Al mismo tiempo, la trometamina actúa como tampón, mejorando la capacidad quelante del EDTA 22. Mientras que el Tris-EDTA ha demostrado tener una actividad frente al biofilm de P. aeruginosa, los efectos sobre Staphylococcus spp. son variables, siendo frecuente que inhiba el crecimiento de estas bacterias en lugar de erradicarlas 13. Cabe señalar que la combinación de Tris-EDTA con determinados antimicrobianos podría reducir la eficacia antibacteriana, por lo que se necesita seguir investigando para comprender estas interacciones. Sin embargo, el Tris-EDTA destaca como coadyuvante junto con algunos antimicrobianos, demostrando un efecto sinérgico. Los estudios in vitro han demostrado que el Tris-EDTA puede reducir la concentración bactericida mínima (CBM) y la concentración inhibitoria mínima (CIM), potenciando así la eficacia de antibióticos como la marbofloxacina y la gentamicina, especialmente en casos de P. aeruginosa multirresistente 22.

Además del Tris-EDTA, existen otros compuestos con actividad frente al biofilm, ampliando las herramientas disponibles contra las infecciones bacterianas. Por ejemplo, las nanopartículas de plata, la povidona yodada y la miel ofrecen alternativas para el tratamiento del biofilm 23,24. Además, se están realizando grandes descubrimientos en las investigaciones actuales. Algunas innovaciones como el plasma frío atmosférico por microondas, los inhibidores del quorum sensing y los bacteriófagos están surgiendo como posibles agentes con actividad frente al biofilm 23,25. Estos enfoques resultan prometedores en cuanto a la mejor capacidad para afrontar los problemas relacionados con el biofilm, permitiendo albergar la esperanza de que en un futuro se implementen estrategias terapéuticas más eficaces.

Conclusión

La formación del biofilm representa un importante factor de virulencia en diversas infecciones bacterianas, como las producidas por Pseudomonas spp. y Staphylococcus spp., especialmente en el contexto de la otitis crónica. Sin embargo, es esencial no olvidar el papel de las levaduras como Malassezia spp en el biofilm. En casos en los que el tratamiento no funcione y se observen unas características macroscópicas y microscópicas específicas, es esencial considerar la posible implicación del biofilm. Sospechar y detectar la presencia del biofilm puede hacer que se adopten las estrategias terapéuticas más adecuadas y que exista una mayor posibilidad de erradicar estas infecciones tan rebeldes.