Citologia diagnóstica prática para clínicos

Introdução

A citologia (ou seja, o estudo de lesões em nível celular) é altamente eficaz e amplamente utilizada por médicos-veterinários no diagnóstico e na avaliação de várias doenças, incluindo inflamação, lesão, infecção, hiperplasia e neoplasia. Trata-se de um procedimento relativamente fácil, barato, confiável, rápido e minimamente invasivo (Quadro 1). A técnica costuma ser aplicada a aspirados por agulha fina de nódulos (‘caroços’), inchaços ou outras lesões inexplicáveis em qualquer região do corpo externamente (Figura 1). Além disso, o exame citológico pode ser usado para avaliar células recuperadas por raspados de lesões cutâneas, swabs de superfícies mucosas, e impressões diretas de lesões, biopsias teciduais ou superfícies teciduais em lâminas de vidro. Também é comumente aplicado a (i) líquidos obtidos por lavagens de espaços nasais, traqueais, brônquicos e alveolares, (ii) líquidos coletados por cateterização da bexiga e próstata, e (iii) aspirados de líquidos de cavidades corporais e articulações. O aspirado por agulha fina guiada por ultrassom de massas ou órgãos como fígado, baço e rim é cada vez mais empregado para avaliar lesões internas.

Quadro 1. Vantagens da citologia diagnóstica.

Prós e contras da citologia

Os achados citológicos estão altamente correlacionados com aqueles da biopsia tecidual para histopatologia. No entanto, quando comparada à histologia, as limitações da técnica de citologia consistem na recuperação muito maior de células, bem como na obtenção de mais informações sobre a arquitetura e a interação entre células, proporcionados pelo exame histopatológico e não pelo citológico. Algumas características arquitetônicas significativas podem ser vistas com a citologia, como células em paliçada em tumores de células basais, associação com capilares em lipomas e hemangiopericitomas, formações acinotubulares e matriz extracelular em tecido secretor, e formações papilares em tecidos epiteliais. Contudo, as informações em nível celular e subcelular obtidas com a citologia podem ser necessárias para o diagnóstico de algumas condições, como nos casos de hemangiopericitoma; além disso, amostras citológicas bem preparadas são livres da retração ou encolhimento e de outros artefatos de fixação com formaldeído encontrados na histologia. Isso pode ser relevante em diagnósticos que se baseiam principalmente  na avaliação do tamanho das células, como o linfoma.

Para a maioria dos achados de citologia, as habilidades e os conhecimentos necessários para adquirir e processar uma amostra e, então, avaliá-la por meio microscópico são relativamente básicos para os médicos-veterinários, embora uma abordagem inadequada possa invalidar uma amostra (Quadro 2). É provável que as lesões inflamatórias sejam identificadas com mais facilidade (Quadro 3), pois se baseiam em grande parte na identificação dos tipos de células sanguíneas recebidas e na formação de macrófagos, bem como na avaliação da gravidade. As células de determinados tecidos são facilmente reconhecíveis por algumas características morfológicas diferentes – por exemplo, cerca de 80% dos tumores de pele são de apenas 10 tipos – e os clínicos podem aprender rapidamente a diagnosticar os achados citológicos mais comuns e encaminhar ao especialista aqueles que exigem mais experiência. Além disso, ao longo das últimas duas décadas, uma vasta gama de livros didáticos úteis, manuais, atlas e literatura especializada relevante orientada aos profissionais tornou-se amplamente disponível, tanto em cópia impressa como em formato digital na Internet.

Quadro 2. Cinco razões para preparações citológicas não diagnósticas.

Quadro 3. Uma abordagem algorítmica para exame citológico de cisto, nódulo (‘caroço’) ou protuberância.

Durante esse período, as tecnologias e os conhecimentos também evoluíram significativamente, sobretudo no que diz respeito à aquisição, à análise e ao armazenamento de imagens microscópicas de alta qualidade. Equipamentos como microscópio, telefone celular, computador, atlas colorido e centrífuga clínica são os únicos necessários depois que uma amostra é adquirida, esfregada e corada. Do ponto de vista comercial e financeiro, também vale destacar que a citologia se tornou um componente importante da patologia clínica no funcionamento das clínicas veterinárias. Curiosamente, supervisores e examinadores na especialidade de patologia clínica costumam notar que os residentes passam a maior parte do seu tempo na (e pendem para a) subespecialidade de citologia, apresentando melhor desempenho e pontuação nessa área, em comparação com outros campos da patologia clínica, como bioquímica, patologia geral, hematologia, e gestão laboratorial.

Aquisição eficaz de amostras e geração eficiente de imagens

Normalmente, para uma única lesão, os clínicos enviam de 1 a 4 esfregaços. Esses esfregaços são avaliados quanto à celularidade, conservação celular, presença de inflamação (Quadro 4), e características malignas (Quadro 5). Amostras de qualidade diagnóstica terão celularidade suficiente e serão fixadas corretamente, com as células bem distribuídas e contaminação sanguínea mínima. As amostras costumam ser adquiridas por aspiração, mas ocasionalmente pela simples inserção de agulha quando as células se encontram separadas, como em linfomas. A aspiração com o uso de agulha de calibre 22-23G e seringa de 20 mL é feita com alguns movimentos de vaivém (i. e., para frente e para trás),  a fim de recuperar células de uma área maior e mais representativa da lesão. O conteúdo aspirado é colocado em lâminas com a agulha mantida em um ângulo de 45 graus. O esfregaço é realizado, de preferência, utilizando uma segunda lâmina posicionada em cima da primeira e lentamente retraída no sentido horizontal, com pressão vertical mínima, e seguida de secagem rápida, agitando as lâminas no ar por 30 segundos ou colocando-as na frente de um ventilador de alta velocidade ou secador de cabelo. Isso evita a retração e a dissolução das células.

Quadro 4. Avaliação citológica da inflamação.

Quadro 5. Critérios de malignidade (> 3 necessários).

É mais eficiente realizar o exame de microscopia óptica com um microscópio trinocular equipado com uma câmera digital conectada a um computador para captura de múltiplas imagens. Alternativamente, pode-se utilizar uma câmera de celular com a função de zoom para obter imagens de perto das células (Figura 3). As fotomicrografias devem ser otimizadas por meio digital, ajustando o brilho, o contraste e o equilíbrio de branco do fundo, o que removerá a distorção típica da cor amarela do fundo. As imagens devem ser cortadas para focar em características diagnósticas relevantes. Vários pacotes de software de processamento de imagem gratuitos permitem colagens automáticas de 4 a 16 imagens otimizadas de diferentes características diagnósticas para conferir uma representação mais abrangente e precisa do esfregaço, facilitando assim o diagnóstico (Figura 4). As colagens de imagens diagnósticas podem ser transferidas por meio digital para relatórios como arquivos em jpeg, compartilhadas ao vivo em programas de conferência em tempo real, ou armazenadas para futuras comparações ou estudos.

A citologia começa com o exame macroscópico de uma lâmina para avaliar de forma preliminar a suficiência ou o excesso de células, qualquer sangue/lipídio contaminante, qualquer estrutura macroscópica (por exemplo, aglomerados de células, larvas), e qualquer artefato evidente de esfregaço/secagem. Em seguida, a microscopia direta é realizada em 3 níveis diferentes de aumentos em um processo iterativo e gradual:

I) ~10-20× para digitalização abrangente de grandes estruturas, obtenção de informações arquiteturais, e identificação das áreas mais diagnósticas;

II) ~40-60× para refinamento e resolução ainda maior dos detalhes;

III) 100× em óleo para aquisição de detalhes celulares/subcelulares aprofundados.

Citologia e neoplasia

Uma revisão das amostras enviadas ao laboratório universitário dos autores fornece algumas estatísticas interessantes e demonstra a utilidade da citologia na investigação de um possível tumor. Cerca de 95% dos 7.560 casos (dos quais 62% correspondiam a remessas internas e 38% vinham de clínicas externas) eram de cães. No total, 14% das amostras não foram diagnósticas em virtude da recuperação insuficiente de células intactas (Quadro 2), e 19% dos casos com lâminas legíveis (i. e., passíveis de leitura) eram neoplásicas (64% eram malignas); já o restante era principalmente de natureza inflamatória.

Das três categorias citológicas de neoplasia, os tumores mesenquimais apresentaram a maior prevalência geral (42%), dos quais 98% eram caninos e 2% felinos, seguidos de tumores de células redondas (32%), dos quais 88% eram caninos/12% felinos, e tumores epiteliais (26%), dos quais 93% eram caninos/7% felinos. As neoplasias malignas em cães tinham a seguinte prevalência: 30% de linfomas, 27% de carcinomas, 26% de sarcomas, 13% de mastocitomas e 4% de tumores neuroendócrinos. Já os tumores benignos em cães consistiam em 65% de lipomas, 16% de adenomas, 7% de histiocitomas, e 5% de hemangiopericitomas. Embora houvesse pouquíssimos tumores benignos em gatos para avaliar, observaram-se 75 tumores malignos nessa espécie: 52% de linfomas, 30% de carcinomas, 9% de sarcomas, 4% de mastocitomas, e 3% de plasmocitomas.

Os cinco principais tumores representavam 84% do total de tumores diagnosticados na população canina e 98% na felina. O lipoma foi o diagnóstico citológico mais comum das neoplasias em cães, diagnosticado com uma frequência duas vezes maior em clínicas externas, mas foi pouco comum em gatos (n = 1). Os mastocitomas foram duas vezes mais comuns em cães (8%) do que em gatos (4%). O linfoma, a neoplasia felina mais comum, foi diagnosticado com uma frequência duas vezes maior em gatos do que em cães. Mais de um terço das neoplasias malignas eram constituídas de sarcomas e carcinomas; tais neoplasias foram diagnosticadas com uma frequência três vezes maior em amostras de nossa clínica especializada. Uma descrição dos tumores mais comuns pode ser encontrada clicando neste link (em inglês).

Critérios de malignidade

O diagnóstico de tumores malignos (câncer) é algo crucial. Ao exame citológico, a maioria das malignidades pode ser efetivamente diagnosticada com o achado de pelo menos 3 critérios específicos em uma proporção considerável de células (Quadro 5). Os tumores benignos são caracterizados pela aparência semelhante das células entre si. Em contraste, as células malignas são caracterizadas por uma ampla variação no formato e tamanho das células, bem como de seus núcleos e nucléolos. Essas células tendem a ser caracterizadas por termos que usam prefixos gregos (por exemplo, pleo, aniso, macro, xeno, hiper) e, por isso, pode ser útil recordar esses critérios.

Classificações de tumores

Os tumores malignos na citologia são divididos, de acordo com sua origem e morfologia, em três grupos:

• As amostras de tumores mesenquimais (sarcomas, se malignos) costumam ter uma celularidade baixa a moderada, com células encontradas isoladamente ou em aglomerados pouco coesos com bordas celulares mal definidas, ocasionalmente associadas a uma matriz extracelular rósea. Cada célula tem uma aparência fusiforme (i. e., de fuso) com núcleos ovais levemente alongados e quantidades moderadas de citoplasma basófilo pálido que frequentemente aparece como extensões uni ou bipolares. Às vezes, observa-se granulação citoplasmática fina, puntiforme e vermelha.
• Os tumores epiteliais (carcinomas, se malignos) tendem a ter células redondas a poligonais, com um núcleo redondo e citoplasma basófilo abundante; as células esfoliam em aglomerados. A borda das células é mais evidente do que em um sarcoma, mas menos óbvia do que nos casos de tumores de células redondas.
• Os tumores discretos de células redondas são altamente esfoliativos; portanto, a amostragem frequentemente recupera um grande número de células solitárias discretas. Ocasionalmente, elas se agregam em grandes aglomerados compostos por multicamadas, com pouco ou nenhum detalhe celular. A maioria dos tipos de células redondas é propensa à ruptura e, por essa razão, há necessidade de um cuidado extra durante o processamento das amostras.

Considerações finais

Adquirir e processar uma amostra e, então, avaliá-la por meio microscópico, são habilidades relativamente básicas que podem ser aplicadas na clínica com facilidade; por essa razão, a citologia está desempenhando um papel cada vez mais importante no diagnóstico de pequenos animais. Lesões inflamatórias são as mais facilmente identificadas, pois se baseiam em grande parte na identificação dos tipos de células sanguíneas; no entanto, os tumores costumam ter características típicas que também permitirão a identificação em muitos casos. Os clínicos podem aprender rapidamente a diagnosticar os achados citológicos mais comuns e encaminhar ao especialista aqueles que exigem mais experiência.

Sugestões de leitura adicionais

• O’Brien PJ, Lumsden JH. The cytological examination of body cavity fluids. Sem. Vet. Med. Surg. Small Anim. 1988;3:140-156.
• Metcalfe LVA, O’Brien PJ, Papakonstantinou S, et al. Malignant melanoma in a grey horse: case presentation and review of equine melanoma treatment options. Ir. Vet. J. 2013;66:22-26.
• Papakonstantinou S, O’Brien PJ. High content imaging for the morphometric diagnosis and immunophenotypic prognosis of canine lymphomas. Cytometry: Part B – Clinical Cytometry Doi: 10.1002/cytob.21170; 2014.
• Domingos M, Davies AM, O’Brien PJ. Application of high content analysis in clinical cytology for translational safety biomarkers of drug-induced toxicity for lymphoma chemotherapy. Basic Clin. Pharmacol. Toxicol. 2014;115:145-153.
• Balan M, O’Brien PJ, McCullough M. Marked paraneoplastic basophilia accompanying eosinophilia in a cat with alimentary T-cell lymphoma. J. Feline Med. Surg. Open Reports 2017;3(2):1-6.
• Balda IO, O’Brien PJ, Mullins RA, et al. Intraoperative impression smear cytology to guide successful treatment of a large renal cyst in a dog: a case report. J. Vet. Sci. 2022;23(2):e34.
• Martínez-Caro J, O’Brien PJ. Novel, diagnostic, cytomorphometric profile of canine, classical haemangiopericytoma: including nuclear criteria of malignancy. Comp. Clin. Pathol. 2023;32(2):299-310.