Citologia diagnostica pratica per i Medici Veterinari

Introduzione

La citologia (cioè, lo studio delle lesioni a livello cellulare) è molto efficace e ampiamente utilizzata dai Medici Veterinari nella diagnosi e nella valutazione di varie condizioni patologiche, tra cui infiammazioni, lesioni, infezioni, iperplasia e neoplasia. È relativamente facile, economica, affidabile, minimamente invasiva e rapida (Riquadro 1), e la tecnica viene spesso applicata agli agoaspirati con ago sottile di noduli, gonfiori o altre lesioni inspiegabili in qualsiasi parte esterna del corpo (Figura 1). Inoltre, può essere utilizzata per valutare le cellule recuperate mediante raschiati da lesioni cutanee, tamponi da superfici mucosali, e impronte dirette su vetrini di lesioni, biopsie tissutali o superfici tissutali. Inoltre, viene spesso applicata ai fluidi provenienti da lavaggi degli spazi nasali, tracheali, bronchiali e alveolari, dalla cateterizzazione della vescica e della prostata, e da aspirati di cavità corporee e fluidi articolari. Per valutare le lesioni interne di masse o di organi come ad esempio fegato, milza e reni, si usa sempre più spesso l’agoaspirato con ago sottile sotto guida ecografica. 

Riquadro 1. Vantaggi della citologia diagnostica.

Pro e contro della citologia

I riscontri citologici sono estremamente correlati con quelli della biopsia tissutale per l’istopatologia. Tuttavia, i limiti della tecnica rispetto all’istologia sono la resa molto maggiore di cellule e le maggiori informazioni sull’architettura e sull’interazione inter-cellulare fornite da quest’ultima. La citologia consente di osservare alcune caratteristiche architettoniche significative, come ad esempio le cellule a palizzata nei tumori basocellulari, l’associazione con i capillari nei lipomi e negli emangiopericitomi, le formazioni acinari e tubolari e la matrice extracellulare nel tessuto secretore, e le formazioni papillari nei tessuti epiteliali. Tuttavia, per la diagnosi di alcune condizioni possono essere necessarie le informazioni a livello cellulare e subcellulare ottenute con la citologia come, ad esempio, nel caso dell’emangiopericitoma e i campioni citologici ben preparati sono esenti dalla contrazione e da altri artefatti riscontrati nell’istologia e dovuti alla fissazione con formaldeide. Ciò può essere significativo nelle diagnosi basate in gran parte sulla valutazione delle dimensioni cellulari, come ad esempio il linfoma.

Per la maggior parte dei riscontri citologici, le competenze e conoscenze necessarie per acquisire e trattare un campione, e quindi valutarlo al microscopio, sono relativamente primarie per i Medici Veterinari, anche se un approccio maldestro può invalidare il campione (Riquadro 2). Le lesioni infiammatorie sono probabilmente quelle più facili da identificare (Riquadro 3) poiché ci si basa in gran parte sul riconoscimento dei tipi di cellule provenienti dal sangue e sulla formazione dei macrofagi, nonché sulla valutazione della gravità. Le cellule di alcuni tessuti sono facilmente riconoscibili in base a poche caratteristiche morfologiche; ad esempio, circa l’80% dei tumori cutanei è rappresentato da appena 10 tipi, e i Medici Veterinari possono imparare rapidamente a diagnosticare i riscontri citologici più comuni e inviare allo specialista quelli che richiedono maggiore esperienza. Inoltre, negli ultimi due decenni, è diventata ampiamente disponibile una vasta gamma di utili libri di testo, manuali, atlanti e letteratura pertinente orientata al Medico Veterinario, sia in formato cartaceo che digitale su Internet. 

Riquadro 2. 5 motivi per la produzione di preparati citologici non diagnostici. 

Riquadro 3. Approccio algoritmico all’esame citologico di una cisti, un nodulo o una protuberanza.

Anche la tecnologia e le conoscenze si sono sviluppate notevolmente in questo periodo, soprattutto per quanto riguarda l’acquisizione, l’analisi e la memorizzazione di immagini microscopiche di alta qualità. Un microscopio, uno smartphone, un computer, un atlante a colori e una centrifuga clinica sono le uniche attrezzature necessarie dopo aver acquisito il campione ed eseguiti lo striscio e la colorazione. È anche importante notare che, dal punto di vista economico e finanziario, la citologia è diventata una componente importante della patologia clinica nell’operatività delle cliniche veterinarie. Ancora più interessante è considerare che i supervisori e gli esaminatori nella specialità di patologia clinica notano spesso che gli specializzandi spendono la maggior parte del tempo nella specialità secondaria della citologia, oltre a esserne attratti e ottenere risultati migliori in questa branca, rispetto agli altri campi della patologia clinica come biochimica, patologia generale, ematologia e gestione di laboratorio.

Efficacia nell’acquisizione e nella traduzione in immagini dei campioni

In genere, per una singola lesione, i clinici inviano 1-4 strisci. Questi vengono valutati in termini di cellularità, conservazione cellulare e presenza dell’infiammazione (Riquadro 4), oltre alle caratteristiche maligne (Riquadro 5). I campioni di qualità diagnostica hanno una cellularità sufficiente e sono fissati correttamente, con le cellule ben distribuite e una contaminazione ematica minima. I campioni vengono solitamente acquisiti mediante aspirazione, e talvolta mediante semplice inserimento dell’ago quando le cellule sono separate, come ad esempio nei linfomi. L’aspirazione con un ago da 22-23 G e una siringa da 20 mL viene eseguita utilizzando alcuni movimenti avanti e indietro per recuperare le cellule da un’area più ampia e più rappresentativa della lesione. Il contenuto aspirato viene distribuito sui vetrini tenendo l’ago a un angolo di 45 gradi. Idealmente, lo striscio va eseguito utilizzando un secondo vetrino messo sopra il primo e tirato lentamente indietro in senso orizzontale, applicando una pressione verticale minima; quindi, si prosegue essiccando rapidamente i vetrini agitandoli in aria per circa 30 secondi o mettendoli davanti a un potente ventilatore o un asciugacapelli. Ciò impedisce la contrazione e la dissoluzione delle cellule.

Riquadro 4. Valutazione citologica dell’infiammazione.

Riquadro 5. Criteri di malignità (sono necessari >3).

Il modo migliore per eseguire l’esame in microscopia ottica prevede l’uso di un microscopio trinoculare dotato di fotocamera digitale collegata al computer per l’acquisizione di immagini multiple. In alternativa, per ottenere immagini ravvicinate delle cellule è possibile utilizzare la fotocamera dello smartphone con la funzione zoom (Figura 3). Le microfotografie devono essere ottimizzate digitalmente regolando la luminosità, il contrasto e il bilanciamento del bianco dello sfondo, in modo da rimuoverne il tipico colore giallastro. Le immagini dovrebbero essere ritagliate per concentrarsi sulle caratteristiche diagnostiche significative. Vari pacchetti software gratuiti di elaborazione delle immagini consentono di creare automaticamente collage di 4-16 immagini ottimizzate delle varie caratteristiche diagnostiche, in modo da fornire una rappresentazione più completa e accurata dello striscio e facilitare quindi la diagnosi (Figura 4). I collage di immagini diagnostiche possono essere trasferiti digitalmente nei referti come file jpeg, condivisi dal vivo attraverso programmi di conferenza in tempo reale, o archiviati per effettuare confronti o studi futuri.

La citologia inizia con l’esame macroscopico di un vetrino per valutare preliminarmente la sufficienza o l’eccesso di cellule, la presenza di contaminanti ematici/lipidici, le eventuali strutture macroscopiche (ad es. grumi cellulari, larve), e qualsiasi artefatto evidente collegato all’esecuzione dello striscio/all’essiccazione. Quindi, si esegue la microscopia diretta con 3 diversi livelli di ingrandimento in un processo iterativo graduale; 

I) ~10-20x per la scansione completa delle strutture voluminose, per ottenere informazioni sull’architettura, e identificare le aree più diagnostiche, 

II) ~40-60x per affinare ulteriormente e risolvere il dettaglio, 

III) 100x per i dettagli cellulari/subcellulari approfonditi.

Citologia e neoplasia

Una revisione dei campioni inviati al laboratorio universitario degli autori fornisce alcune statistiche interessanti, e dimostra l’utilità della citologia quando si indaga su un possibile tumore. Circa il 95% dei 7.560 casi (di cui il 62% erano invii interni, il 38% da cliniche esterne) riguardava i cani. In totale, il 14% dei campioni non era diagnostico a causa del recupero insufficiente di cellule intatte (Riquadro 2), e il 19% dei casi con vetrini leggibili era di tipo neoplastico (il 64% maligno), mentre il resto era per lo più infiammatorio.

Delle tre categorie di neoplasia citologica, i tumori mesenchimali avevano la massima prevalenza complessiva (42%), e di questi il 98% riguardava i cani e il 2% i gatti, seguiti dai tumori a cellule rotonde (32%), di cui 88% canini/12% felini, e i tumori epiteliali (26%), di cui 93% canini/7% felini. I cancri canini erano per il 30% linfomi, per il 27% carcinomi, per il 26% sarcomi, per il 13% mastocitomi e per il 4% tumori neuroendocrini. I tumori benigni canini erano per il 65% lipomi, per il 16% adenomi, per il 7% istiocitomi, e per il 5% emangiopericitomi. C’erano troppo pochi tumori felini benigni da valutare, ma 75 erano tumori felini maligni: 52% linfomi, 30% carcinomi, 9% sarcomi, 4% mastocitomi, e 3% tumori plasmacellulari.

I primi cinque tumori rappresentavano l’84% del totale dei tumori diagnosticati nella popolazione canina e il 98% in quella felina. Il lipoma era la diagnosi citologica più comune delle neoplasie canine, diagnosticato due volte più spesso nelle strutture esterne, mentre era raro nei gatti (n=1). I mastocitomi erano due volte più comuni nei cani (8%) rispetto ai gatti (4%). Il linfoma, la neoplasia felina più comune, era diagnosticata due volte più spesso nei gatti rispetto ai cani. Più di un terzo dei cancri era costituito da sarcomi e carcinomi, e venivano diagnosticati tre volte più spesso nei campioni provenienti dalla struttura specializzata degli autori. Una descrizione dei tumori più comuni può essere trovata  cliccando su questo link.

Criteri di malignità

La diagnosi dei tumori maligni (cancro) è critica. Dal punto di vista citologico, la maggior parte delle malignità può essere diagnosticata efficacemente individuando almeno 3 criteri specifici in una porzione considerevole delle cellule (Riquadro 5). I tumori benigni sono caratterizzati dalla somiglianza nell’aspetto delle cellule. Al contrario, le cellule cancerose sono caratterizzate da un’ampia variazione in termini di forma e dimensione delle cellule, dei nuclei e dei nucleoli. Queste tendono a essere chiamate con termini che utilizzano prefissi greci (ad es., pleo, aniso, macro, xeno, iper) e può essere utile ricordare tali criteri.

Classificazioni dei tumori

I tumori maligni nella citologia si dividono in tre gruppi, in base alla loro origine e morfologia: 

• I campioni dei tumori mesenchimali (sarcomi, se maligni) hanno solitamente una cellularità da bassa a moderata, con il riscontro di cellule singole o in cluster lassamente coesi con margini cellulari scarsamente definiti, talvolta associate a una matrice extracellulare rosa. Le singole cellule hanno aspetto fusiforme con nuclei ovali leggermente allungati, e quantità moderate di citoplasma pallido-basofilo che appare spesso in forma di estensioni uni-/bipolari. Talvolta si nota una granulazione citoplasmatica puntiforme, fine e di colore rosso.
• I tumori epiteliali (carcinomi, se maligni) tendono ad avere cellule da rotonde a poligonali con nucleo rotondo e abbondante citoplasma basofilo; le cellule esfoliano in cluster. Il margine cellulare è più evidente rispetto al sarcoma, ma meno evidente in confronto ai tumori a cellule rotonde.
• I tumori a cellule rotonde discreti sono estremamente esfoliativi; quindi, il prelievo recupera spesso un numero elevato di cellule discrete e solitarie. Talvolta, queste si aggregano in grandi cluster multi-stratificati con dettagli cellulari limitati o nulli. Quasi tutti i tipi di celle rotonde sono soggette a rottura, ed è pertanto necessaria particolare attenzione durante il trattamento del campione.

Conclusione

L’acquisizione, il trattamento e la valutazione al microscopio di un campione sono competenze relativamente primarie che possono essere facilmente applicate in clinica, e la citologia sta svolgendo un ruolo sempre più importante nella diagnostica dei piccoli animali. L’identificazione delle lesioni infiammatorie è la più facile perché si basa in gran parte sul riconoscimento dei tipi di cellula ematica, ma i tumori hanno spesso caratteristiche tipiche che ne consentono quasi sempre l’identificazione. I Medici Veterinari possono imparare rapidamente a diagnosticare i riscontri citologici più comuni, e inviare allo specialista quelli che richiedono maggior esperienza.

Ulteriori letture

• O’Brien PJ, Lumsden JH. The cytological examination of body cavity fluids. Sem. Vet. Med. Surg. Small Anim. 1988;3:140-156.
• Metcalfe LVA, O’Brien PJ, Papakonstantinou S, et al. Malignant melanoma in a grey horse: case presentation and review of equine melanoma treatment options. Ir. Vet. J. 2013;66:22-26.
• Papakonstantinou S, O’Brien PJ. High content imaging for the morphometric diagnosis and immunophenotypic prognosis of canine lymphomas. Cytometry: Part B – Clinical Cytometry Doi: 10.1002/cytob.21170; 2014.
• Domingos M, Davies AM, O’Brien PJ. Application of high content analysis in clinical cytology for translational safety biomarkers of drug-induced toxicity for lymphoma chemotherapy. Basic Clin. Pharmacol. Toxicol. 2014;115:145-153.
• Balan M, O’Brien PJ, McCullough M. Marked paraneoplastic basophilia accompanying eosinophilia in a cat with alimentary T-cell lymphoma. J. Feline Med. Surg. Open Reports 2017;3(2):1-6.
• Balda IO, O’Brien PJ, Mullins RA, et al. Intraoperative impression smear cytology to guide successful treatment of a large renal cyst in a dog: a case report. J. Vet. Sci. 2022;23(2):e34.
• Martínez-Caro J, O’Brien PJ. Novel, diagnostic, cytomorphometric profile of canine, classical haemangiopericytoma: including nuclear criteria of malignancy. Comp. Clin. Pathol. 2023;32(2):299-310.