Ematologia canina: FAQ

Introduzione

Per interpretare correttamente i dati ematologici nella clinica veterinaria, i risultati devono riflettere le reali condizioni del cane. Questo è essenziale per una diagnosi accurata e un trattamento appropriato. Il Medico Veterinario deve saper rispettare diverse condizioni per garantire la qualità e l’affidabilità dei risultati ottenuti durante l’analisi ematologica. In particolare, deve garantire il controllo della qualità dell’analizzatore ematologico, l’identificazione di eventuali fonti di errore (pre-analitico, analitico e post-analitico) e il confronto dei risultati con quelli degli strisci di sangue. Questo articolo, in forma di domande e risposte, illustra le insidie che si incontrano più frequentemente quando si eseguono esami ematologici sui cani e si interpretano i risultati.

In che modo la lipemia o l’emolisi influiscono sui risultati ematologici?

La lipemia (Figura 1) aumenta la torbidità del campione e interferisce con la misurazione della concentrazione di emoglobina. Inoltre, a seconda del sistema operativo dell’analizzatore (impedenza o raggio laser), le microgocce lipidiche possono portare a una sovrastima della conta piastrinica, della concentrazione media di emoglobina corpuscolare (MCHC) e della conta totale dei leucociti 1,2. La lipemia è spesso causata dal mancato digiuno. Per limitare o eliminare questa distorsione, i campioni di sangue devono essere prelevati da un animale a digiuno da almeno 12 ore. 

Gli analizzatori ematologici laser misurano il numero di globuli rossi, la concentrazione di emoglobina (sia intracellulare che libera nel plasma) e il volume corpuscolare medio (MCV). Se il sangue è emolizzato, l’MCHF può aumentare, mentre la conta dei globuli rossi e il valore dell’ematocrito sono generalmente inferiori alla norma 3. Il CCMH è uno dei parametri eritrocitari più importanti: valori superiori all’intervallo di riferimento indicano errori o artefatti legati al colore del plasma (emolisi, lipemia) o ad alterazioni morfologiche dei globuli rossi (presenza di sferociti o corpi di Heinz). Quando l’HSCC è elevato, è necessario controllare la qualità del campione e la morfologia dei globuli rossi (Figura 2). 

Alcuni analizzatori a fascio laser possono determinare la concentrazione media di emoglobina cellulare (MCHC). Questo valore viene calcolato direttamente dai globuli rossi, anziché dal loro numero e dalla concentrazione di emoglobina, come nel caso dell’HSCC. Se i valori di HCMC e HSCC sono diversi, ciò indica un’interferenza tra questi parametri; la causa più frequente è la presenza di emoglobina libera nel campione, a seguito di emolisi intravascolare o contaminazione del campione 4,5. La causa più frequente è la presenza di emoglobina libera nel campione, a seguito di emolisi intravascolare o contaminazione del campione 4,5.

Si deve tenere conto della razza del cane nell’interpretazione dei valori ematologici? 

Sì, ignorare le differenze tra razze può portare a errori nell’interpretazione delle analisi. Nel Cavalier King Charles Spaniel è stata identificata una macrotrombocitopenia fisiologica (dovuta a una mutazione nel gene della beta-1 tubulina) 6. Gli analizzatori rilevano queste macropiastrine quando calcolano il piastrinocrito (il volume occupato dalle piastrine); questa misura è importante perché è un indicatore migliore del numero adeguato di piastrine rispetto alla conta piastrinica stessa 7. Se la mutazione è sospetta, può essere confermata con test molecolari. 

Ci sono molti altri esempi. Alcune razze orientali (come Akita inu, Sharpei e Shiba inu) possono presentare una microcitosi fisiologica (eritrociti più piccoli del normale) e un valore di emoglobina reticolocitaria inferiore al limite inferiore dell’intervallo di riferimento per altre razze 8. Nei barboncini, il CVM è normalmente maggiore che in altre razze. L’ematocrito, la conta dei globuli rossi e la concentrazione di emoglobina sono generalmente più elevati nei levrieri rispetto ad altre razze. La conta delle piastrine è spesso più bassa che in altre razze e una lieve leucopenia è comune 9.

Pertanto, quando si confrontano i risultati individuali con gli intervalli di riferimento abituali, si deve sempre tenere conto della specie, dell’età e della razza. È importante conoscere le variazioni osservate in alcune razze di cani.

Posso usare provette di eparina o di citrato per l’ematologia?

L’analisi ematologica viene effettuata su un campione di sangue intero non coagulato grazie alla presenza di EDTA. Anche altri anticoagulanti, come l’eparina o il citrato, sono utilizzati in medicina veterinaria, ma un uso improprio degli anticoagulanti può portare a risultati falsati. Non è possibile eseguire una conta cellulare su sangue intero eparinizzato perché piastrine e leucociti si aggregano spesso nei campioni. L’eparina può essere utilizzata per ottenere il plasma per i test biochimici, mentre il sangue intero in provetta con citrato viene utilizzato principalmente per i test di coagulazione, per ottenere il plasma o per effettuare test viscoelastici. 

Tuttavia, i campioni di sangue citrato-anticoagulato possono essere utilizzati per eseguire una conta cellulare quando nei campioni EDTA è presente un’aggregazione di piastrine o leucociti. In questo caso particolare, si utilizzano provette di citrato (contenenti il 3,2% di citrato di sodio liquido) e il rapporto citrato/sangue deve essere esattamente 1:9. Di conseguenza, i campioni di sangue citrato presentano sempre una leggera emodiluizione, di cui si deve tenere conto quando si analizza il valore fornito dall’analizzatore ematologico 10.

L’EDTA è l’anticoagulante di scelta per le analisi ematologiche. In medicina umana, si raccomanda che il volume del campione prelevato nella provetta non superi di oltre il 10% il volume raccomandato dal produttore. Un riempimento insufficiente o eccessivo influisce sull’accuratezza dei risultati ematologici. Un eccesso di EDTA porta al raggrinzimento dei globuli rossi e alla riduzione del loro volume, con conseguente sottostima del microematocrito e del MCV 10.

Quanto è importante il controllo della qualità per le analisi ematologiche in clinica? 

È essenziale rispettare i protocolli di controllo della qualità quando le analisi ematologiche vengono effettuate in clinica con l’ausilio di un analizzatore. L’American Society of Veterinary Clinical Pathology (ASVCP) ha pubblicato diverse raccomandazioni per migliorare il controllo della qualità in ematologia veterinaria 11,12,13,14 e ha proposto procedure per prevenire gli errori pre-analitici, analitici e post-analitici. I programmi di controllo della qualità interni richiedono l’uso di campioni di controllo, ma è anche necessario avvalersi di controlli della qualità esterni, nazionali o internazionali.

Il valore dell’ematocrito misurato manualmente è confrontabile con quello fornito dall’analizzatore?

In ematologia, gli analizzatori automatici calcolano il valore dell’ematocrito dalla conta dei globuli rossi e dal MCV. Tuttavia, un risultato più accurato e riproducibile può essere ottenuto misurando manualmente il microematocrito in una provetta capillare centrifugata ad alta velocità. La lettura viene effettuata dalla scala graduata sulla colonna degli eritrociti (Figura 3). Tuttavia, una recente indagine condotta su studenti e Medici Veterinari ha rilevato che nel 25% dei casi sono stati commessi errori nel mescolare il sangue prima di riempire la provetta; il 23% ha letto i risultati in modo errato e il 91% non ha riempito le provette di microematocrito in conformità alle raccomandazioni dell’OMS (15,16). Il 23% ha letto i risultati in modo errato e il 91% non ha riempito le provette di microematocrito in conformità alle raccomandazioni dell’OMS 15,16.

Per ridurre il numero di campioni che richiedono la misurazione manuale del microematocrito, è consigliabile studiare la relazione tra la concentrazione di emoglobina e il valore dell’ematocrito. In generale, si applica la regola del 3: il valore dell’ematocrito deve essere circa 3 volte superiore alla concentrazione di emoglobina. Se il valore dell’ematocrito è al di fuori di questo intervallo, si raccomanda di misurare manualmente il microematocrito e di integrare il risultato con i valori dell’analizzatore per MCV e HSCC nell’analisi ematologica 10. 

Occorre inoltre tenere presente che l’ipernatriemia può alterare il valore dell’ematocrito ottenuto con un analizzatore automatico. I globuli rossi di un cane ipernatriemico possono gonfiarsi quando si mescolano con il diluente dell’analizzatore, aumentando falsamente l’MCV e quindi l’ematocrito 17. 

Gli analizzatori rilevano in modo affidabile le deviazioni a sinistra o le conseguenze dell’intossicazione?

L’ASVCP ha pubblicato raccomandazioni per l’esame microscopico degli strisci di sangue e per la conferma dei risultati del conteggio automatico dei diversi tipi di leucociti 14. I pareri degli esperti veterinari sulla valutazione degli strisci di sangue variano: alcuni raccomandano di controllare tutti gli strisci di sangue, mentre altri consigliano di farlo (o di usare un metodo manuale di identificazione dei leucociti) solo se si applicano alcuni criteri specifici. La rilevanza dei diversi approcci dipende dal contesto individuale (animali malati, esami pre-anestetici o geriatrici), dal tipo di analizzatore ematologico utilizzato e dalle competenze del personale di laboratorio. 

Oltre a produrre risultati numerici, gli analizzatori ematologici a raggio laser presentano i risultati in forma grafica, sotto forma di citogrammi. Diversi studi veterinari hanno dimostrato che questi citogrammi sono molto utili per incoraggiare l’esame degli strisci di sangue 18,19. Sulla base di queste informazioni, questo esame è quindi raccomandato quando:

1. il citogramma ottenuto è anormale;
2. l’analizzatore segnala un errore o un potenziale errore nella classificazione dei leucociti; 
3. la conta dei leucociti non rientra nell’intervallo di riferimento. 

Gli analizzatori automatici di raggi laser possono suggerire la presenza di alterazioni legate alla tossicità o alla deviazione verso sinistra (Figura 4), ma sono disponibili pochissime informazioni sulla sensibilità e sulla specificità di questi risultati. È quindi importante prelevare sempre uno striscio di sangue quando un animale è malato, presenta una leucocitosi o quando l’analizzatore invia un allarme (Figura 5).

L’autoagglutinazione o i parassiti possono interferire con gli analizzatori ematologici?

L’autoagglutinazione macroscopica o microscopica (Figura 6) in un campione di sangue suggerisce un processo immuno-mediato. In questo caso, i globuli rossi devono essere lavati con una soluzione fisiologica e il test deve essere ripetuto 20. Se l’autoagglutinazione è confermata, si possono osservare aggregati nel citogramma dell’analizzatore, che li considera come cellule singole; il numero di globuli rossi è quindi artificialmente basso 2. 

È stato dimostrato che la presenza di parassiti del sangue come Babesia spp. (Figura 7) può alterare i citogrammi dei globuli rossi e portare a un falso aumento del numero di reticolociti. Gli analizzatori a fascio laser utilizzano un colorante polimetinico fluorescente che può anche colorare i parassiti presenti nei globuli rossi 21,22. Tuttavia, questo fenomeno si verifica raramente e la sensibilità degli analizzatori nel rilevare i parassiti del sangue rimane sconosciuta; in caso di dubbio, attualmente si raccomanda l’esame di uno striscio di sangue. Dovrebbe inoltre essere effettuata sistematicamente su animali provenienti da regioni in cui la babesiosi o altre malattie trasmesse da vettori sono endemiche 23,24.

La trombocitopenia osservata su un analizzatore ematologico deve essere confermata da uno striscio di sangue?

Uno striscio di sangue dovrebbe essere valutato ogni volta che si rileva un calo della conta piastrinica; gli artefatti associati al trasporto del campione o i problemi durante il prelievo di sangue sono comuni in Medicina veterinaria. Su uno striscio di sangue, il numero di piastrine può essere stimato moltiplicando il numero medio di piastrine per campo osservato (a ingrandimento 1000, immerso in olio) per 15000/µL. Tuttavia, uno studio ha dimostrato che questo metodo di valutazione della conta piastrinica nel cane presenta un livello di variabilità molto elevato. Il risultato dipende dall’operatore e dall’area dello striscio valutato 25.

La mancata convalida della conta piastrinica in tutti i campioni con aggregati piastrinici sarebbe frustrante e probabilmente inutile per la maggior parte dei campioni ematologici. Secondo gli esperti, se la conta piastrinica rientra nel range di riferimento, gli aggregati piastrinici sono clinicamente insignificanti. Tuttavia, è necessario esaminare uno striscio di sangue quando la conta automatica indica trombocitopenia, al fine di valutare gli aggregati piastrinici (Figura 8) 26. I più recenti analizzatori ematologici laser segnalano l’esistenza di aggregati piastrinici e, a seconda del numero e delle dimensioni degli aggregati, il medico può rilevarne la presenza nei citogrammi e negli istogrammi forniti dall’analizzatore. In casi ben definiti, ciò può contribuire a ridurre la necessità di uno striscio di sangue.

Un recente articolo ha valutato il valore nei cani della misurazione della frazione immatura delle piastrine (IPF) utilizzando un analizzatore commerciale. Queste cellule immature sono un segno della rigenerazione delle piastrine da parte del midollo osseo in caso di elevata richiesta. Lo studio ha osservato che, in presenza di aggregati piastrinici, i valori forniti dall’analizzatore erano leggermente sovrastimati 27.

Conclusione

L’ematologia veterinaria ha compiuto notevoli progressi negli ultimi anni, grazie soprattutto ai progressi tecnologici degli analizzatori. Tuttavia, il Medico deve essere consapevole che molti fattori possono influenzare o distorcere i risultati. Per fare una diagnosi corretta, è essenziale padroneggiare la tecnica di campionamento e le condizioni in cui viene maneggiata, e controllare regolarmente l’affidabilità degli analizzatori utilizzati nella pratica clinica, secondo le procedure appropriate. Il prelievo contemporaneo di strisci di sangue è spesso necessario per migliorare l’affidabilità della diagnosi!