Disbiosi del microbioma canino

Introduzione

Il microbioma intestinale è il nome dato all’insieme del genoma di tutti i microbi (cioè batteri, virus, funghi e protozoi) nel tratto gastrointestinale (GI), in cui i batteri sono la componente più abbondante. Il microbioma può essere visto sia come componente del sistema immunitario sia come entità metabolica, poiché i batteri producono metaboliti che interessano il tratto GI e anche altri organi. Disbiosi è il nome dato alle alterazioni che si verificano nel microbioma durante una patologia, e comprende ridotta diversità del microbioma (cioè, numero dei vari batteri), alterazioni nella quantità di batteri, e alterazioni funzionali (ad es. variazioni nella produzione dei metaboliti di origine batterica). La disbiosi è spesso secondaria a patologie intestinali sottostanti e contribuisce ai segni clinici in alcuni pazienti 1; per questo motivo è un marcatore aggiuntivo in corso di patologie intestinali e dev’essere valutato insieme all’anamnesi e alla presentazione clinica del paziente. La terapia per la disbiosi deve puntare ad affrontare la patologia sottostante, e la modifica dell’alimentazione è in prima linea nel supporto in queste circostanze.

Funzione del microbioma 

I batteri producono direttamente (vitamine), oppure convertono i nutrienti (fibre, proteine, grassi) o altre sostanze (es. acidi biliari) in metaboliti di origine batterica, per cui il microbiota esercita molti effetti benefici sull’ospite. Importanti metaboliti includono acidi grassi a catena corta (SCFA), indoli e acidi biliari secondari; questi hanno vari effetti, tra cui azioni antinfiammatorie, modulazione della motilità intestinale, inibizione degli enteropatogeni, miglioramento della funzione di barriera intestinale, e aumento della produzione di mucina 2. La disbiosi, spesso secondaria a vari fattori luminali (Riquadro 1), altera la funzione del microbiota, contribuendo di conseguenza ai segni clinici 1. Di particolare interesse per la regolazione del microbiota sono gli acidi biliari (AB) intestinali. In breve, gli AB primari (acidi colico e acido chenodesossicolico) vengono rilasciati nell’intestino tenue dopo un pasto per favorire la digestione dei grassi. Fino al 95% degli AB viene riassorbito nell’ileo ad opera della circolazione enteroepatica 3, mentre il resto raggiunge il colon dove viene convertito dai batteri (principalmente Clostridium hiranonis, nel cane e nel gatto) in AB secondari 4. Questa conversione ha importanti conseguenze sulla salute, poiché AB secondari, nella giusta quantità, hanno effetti benefici. Agiscono come agonisti per vari recettori distribuiti su vari organi, inducendo effetti antinfiammatori e ipoglicemizzanti, e soppressione degli enteropatogeni 5.

Riquadro 1. Condizioni e fattori associati a disbiosi intestinale.

Valutazione del microbioma

Esistono varie alternative per valutare il microbioma di un cane, alcune più efficaci di altre. 

Coltura batterica

Sebbene sia ancora utilizzata da molti Medici Veterinari per la diagnosi della disbiosi, la coltura batterica fecale è inutile per la valutazione del microbioma, poiché i batteri intestinali sono quasi tutti anaerobi stretti che richiedono terreni di crescita speciali (Figura 1). Di conseguenza, solo una piccola percentuale di specie batteriche può essere messa in coltura dai laboratori diagnostici. In un recente studio, aliquote fecali di cani sani e cani con diarrea cronica sono state inviate a tre laboratori veterinari di riferimento per valutazione della disbiosi 6. Non c’è stato accordo nei risultati colturali tra un laboratorio e l’altro, e in realtà la disbiosi è stata segnalata più spesso nel gruppo dei cani sani. Questo studio dimostra che la coltura batterica non va utilizzata nella valutazione del microbiota in cani con diarrea cronica, ad eccezione di specifici patogeni come ad esempio Salmonella spp. 

Sequenziamento molecolare dei geni dell’rRNA 16S

Le tecniche molecolari basate sul sequenziamento dei geni dell’rRNA 16S danno informazioni complete sulla composizione microbica di un campione fecale, e vengono utilizzate in contesti sperimentali. Diverse aziende offrono il sequenziamento per la valutazione commerciale del microbioma dei singoli animali, ma non esistono attualmente metodi standardizzati (ad es. estrazione del DNA, primer per PCR) tra questi laboratori. Poiché non sono definiti intervalli di riferimento per gli animali, e che ogni azienda fornisce una diversa refertazione, l’interpretazione dei risultati è difficile. Inoltre, è comune la variazione tra i vari assay, per lo più non validati; per questo motivo, la valutazione del microbioma basata sul sequenziamento non è attualmente raccomandata per i singoli pazienti.

Indice di disbiosi (ID) del microbiota canino

L’indice di disbiosi (ID) è un test quantitativo basato su PCR attualmente disponibile in commercio in Nord America ed Europa e viene utilizzato in molti studi clinici 4,7 dato che è l’unico dosaggio validato per valutare la disbiosi del microbioma canino*. L’ID misura i livelli di sette batteri intestinali (Riquadro 2) che sono spesso alterati in cani con enteropatie croniche (EC) o dopo l’uso di antibiotici ad ampio spettro (es. tilosina, metronidazolo) 8,9. Il dosaggio fornisce intervalli di riferimento per questi gruppi batterici, e combina i dati in un singolo numero che esprime l’entità della disbiosi (Figura 2); un ID compreso tra 0 e 2 rappresenta uno scostamento moderato nel microbiota, mentre un ID > 2 indica uno scostamento importante. Il Riquadro 3 illustra la sensibilità e la specificità del metodo.

* https://tx.ag/DysbiosisGI

Riquadro 2. I sette gruppi batterici inclusi nell’indice di disbiosi canina e le variazioni dei loro livelli nella disbiosi.

Riquadro 3. sensibilità e specificità dell’indice di disbiosi (ID) per le enteropatie croniche; un ID pari a 0-2 rappresenta uno scostamento moderato nel microbiota, mentre un valore superiore a 2 indica uno scostamento importante.

Valutando la concentrazione di C. hiranonis, l’ID prevede anche la capacità del microbiota intestinale di convertire AB primari in AB secondari 4. Quantità normali di acidi biliari secondari hanno effetto antimicrobico e sopprimono potenziali enteropatogeni come ad esempio C. difficile, C. perfringens ed E. coli 10; quindi, una combinazione di livelli ridotti di C. hiranonis e minor conversione degli acidi biliari è fortemente associata a disbiosi intestinale e a iperproliferazione di enteropatogeni nel cane (Figura 2) 4,7,8,11. L’identificazione di alcuni o di tutti questi enteropatogeni in un cane con diarrea suggerisce iperproliferazione dovuta a disbiosi sottostante secondaria a un’enteropatia cronica, e non un’infezione primaria. Fino al 60% dei cani con enteropatia cronica (EC) ha livelli ridotti di C. hiranonis e, di conseguenza, una diminuzione di AB secondari 12.

Il microbioma in corso di patologia 

La Tabella 1 riassume i vari modi in cui i batteri intestinali possono contribuire al processo patologico, anche se le patologie sottostanti varieranno tra i singoli pazienti a seconda della localizzazione e della gravità del danno intestinale. Il microbiota è in contatto con lo strato mucoso dell’intestino, il sistema immunitario, e i substrati luminali, quindi qualsiasi cambiamento in uno o più di questi ambienti influenzerà la composizione del microbiota; per questa ragione, la disbiosi è spesso un marcatore precoce di anomalie dell’ambiente intestinale in corso di patologia (Figura 3). 

Tabella 1. Meccanismi attraverso cui i batteri contribuiscono ai disturbi gastrointestinali.

Nei pazienti con insufficienza pancreatica esocrina (EPI) 13, o in animali giovani, a causa del sistema immunitario immaturo, un trattamento con antibiotici ad ampio spettro 8,9 è spesso seguito da disbiosi, limitata principalmente al lume intestinale. Le enteropatie croniche sono accompagnate da infiammazione e distruzione della mucosa e della sua struttura, che determina quantità maggiori di ossigeno sulla superficie mucosale, aumento dei batteri aerobi (E. coli), e riduzione della flora anaerobica normale. La perdita dell’architettura mucosale che si sviluppa in corso di enteropatia cronica si traduce in una riduzione dei trasportatori per carboidrati, aminoacidi, acidi grassi e acidi biliari, con conseguente malassorbimento di questi composti 14. Quantità aumentate di questi composti nel lume GI possono causare direttamente diarrea osmotica o secretoria, nonché iperproliferazione batterica.

A causa della degradazione dello strato mucoso che ricopre l’epitelio, i cani con EC hanno spesso quantità maggiori di batteri aderenti alla mucosa 15. Ciò è collegato alla riduzione di C. hiranonis e quindi ad anomalie nella conversione degli acidi biliari, consentendo un’iperproliferazione secondaria di C. difficile e C. perfringens che può aumentare le risposte proinfiammatorie dell’ospite.

Approccio diagnostico alla disbiosi

Poiché la disbiosi si sviluppa spesso secondariamente ad alterazioni dell’ambiente intestinale in corso di patologie e/o modifiche dei fattori ambientali, deve essere valutata insieme all’anamnesi farmacologica del paziente e alla presentazione clinica. L’interpretazione del risultato dell’ID dovrebbe essere accompagnata dalla valutazione dei livelli dei singoli taxa batterici, e in particolare di C. hiranonis, poiché la riduzione di quest’ultimo è una delle cause principali di anomalie del microbioma. Un ID superiore a 2 indica disbiosi con elevata specificità, mentre un ID nell’intervallo dubbio indica uno scostamento minore nel microbioma fecale. Alcuni cani con EC possono avere un ID < 0 ma presentare alcuni taxa batterici esterni agli intervalli di riferimento, e questo rappresenta una forma minore di disbiosi. In generale, un ID anomalo suggerisce una patologia intestinale sottostante, e sono quindi indicati accertamenti diagnostici per l’EC.

Alcuni farmaci possono influenzare l’ID. Ad esempio, l’omeprazolo può causare un aumento transitorio, ma con livelli normali, di C. hiranonis, e l’ID si normalizza 1-2 settimane dopo la fine della terapia. Gli antibiotici ad ampio spettro (es. metronidazolo e tilosina) possono indurre disbiosi fecale grave (Figura 4); tuttavia, anche in questo caso, nella maggior parte dei cani, il microbiota si normalizza generalmente entro 2-4 settimane dopo la fine della somministrazione, sebbene alcuni soggetti possano avere disbiosi persistente con mancanza di C. hiranonis per diversi mesi 8,11.

Le variazioni nella composizione del microbiota nell’intestino tenue causano spesso alterazioni rilevabili nel microbioma fecale come valutato dall’ID. Tuttavia, in alcuni pazienti, l’aumento di batteri nell’intestino tenue possono causare patologia. La disbiosi a livello dell’intestino tenue è suggestiva se le concentrazioni sieriche di folato sono aumentate e la cobalamina sierica è diminuita, ma entrambi i marcatori hanno bassa sensibilità e specificità.

Terapia per la disbiosi 

Spesso, la disbiosi è semplicemente una componente della patologia intestinale, e richiede un approccio multimodale alla causa sottostante. In alcuni casi, come ad esempio negli animali con EPI, l’integrazione con enzimi pancreatici migliora i segni clinici, e il microbioma intestinale spesso si normalizza dopo diverse settimane 13; invece, i cani con EC non hanno marcatori capaci di prevedere quale sia il trattamento migliore per il singolo paziente, cosa che richiede spesso trattamenti ex-juvantibus graduali 16. Le terapie per la disbiosi comprendono la modulazione dietetica, i prebiotici e i probiotici, gli antimicrobici, e il trapianto di microbiota fecale (FMT), dove ogni approccio affronta un meccanismo diverso (Tabella 2); una combinazione di trattamenti offre spesso il successo maggiore. 

Tabella 2. Opzioni terapeutiche per la disbiosi. 

Le modifiche dell’alimentazione dovrebbero essere sempre la prima scelta in pazienti stabili. Vari studi hanno dimostrato che il 50-70% dei cani con EC risponde alla modifica dell’alimentazione 16, e che gli alimenti usati più spesso sono quelli molto digeribili contenenti proteine idrolizzate o nuove fonti proteiche. La maggior parte di questi alimenti sono ipoallergenici e riducono la presenza di elementi indigeriti nel lume gastrico e intestinale, diminuendo così il rischio di iperproliferazione batterica. Nella maggior parte dei casi di enteropatia responsiva all’alimento, il solo cambiamento alimentare è sufficiente per ottenere la remissione clinica, migliorando gradualmente l’infiammazione intestinale e la disbiosi nell’arco di diversi mesi 10,17. 

I probiotici possono essere somministrati da soli nei casi lievi, oppure insieme alla modifica dell’alimento. Poiché il numero di batteri in qualsiasi probiotico è limitato rispetto al microbiota intestinale esistente, l’impatto diretto sulla composizione del microbiota è basso. Tuttavia, questi batteri si fissano alla mucosa e possono esercitare effetti benefici, tra cui ridurre la durata della diarrea acuta e degli effetti indesiderati associati agli antibiotici, come vomito o diarrea 18. È stato dimostrato che i probiotici multi-ceppo ad alta potenza riducono la presenza di C. perfringens in cani con diarrea emorragica acuta 19 e rafforzano la barriera intestinale in cani con EC 20. Tuttavia, poiché molti prodotti commerciali non sono sottoposti a controlli di qualità adeguati, è importante scegliere una preparazione che abbia dimostrato la propria efficacia in studi clinici pubblicati. 

I prebiotici sono carboidrati indigeribili che promuovono la crescita di microrganismi benefici e possono essere suddivisi in fibre solubili/insolubili e fibre fermentescibili/non fermentescibili. Le fibre fermentescibili vengono convertite in acidi grassi a corta catena (SCFA) dai batteri del colon. La maggior parte degli alimenti commerciali formulati per la gestione dei disturbi gastrointestinali contiene prebiotici, ma per alcune patologie (come la colite) possono essere utili alimenti ad alto contenuto di fibra. La presenza di buccia di psillium, una fibra solubile, nel quantitativo di 0,5-1 g/kg di peso corporeo al giorno, può migliorare la qualità fecale in animali con patologie dell’intestino crasso. Lo psillium deve essere introdotto alla dose inferiore, e titolato fino a ottenere la consistenza fecale desiderata. 

Antibiotici come tilosina o metronidazolo sono stati tradizionalmente raccomandati nel trattamento dell’EC, ma il loro uso di prima linea è attualmente controverso 16. Sebbene possano migliorare i segni clinici, presumibilmente attraverso la riduzione della carica batterica, portano spesso a recidiva dopo il trattamento non appena i batteri proliferano di nuovo, poiché è raro che gli antibiotici risolvano il processo patologico sottostante 15,21,22. Le opzioni spesso utilizzate includono il metronidazolo (10-15 mg/kg ogni 12 ore) e la tilosina (25 mg/kg ogni 12 ore) per 4-6 settimane; tuttavia, come notato sopra, entrambi i farmaci hanno dimostrato di indurre disbiosi dell’intestino crasso, che può talvolta durare mesi 8,9,11. Studi segnalano che il metronidazolo promuove disbiosi duratura in cani con diarrea acuta 11, mentre l’associazione amoxicillina-acido clavulanico può favorire un aumento di E. coli resistent 23. Per vari motivi, gli antibiotici non sono generalmente raccomandati come trattamento di prima linea nell’EC: solo il 10-16% dei cani con EC risponde agli antibiotici, la maggior parte dei casi recidiva dopo l’interruzione del trattamento, e i farmaci hanno effetti negativi sul microbioma. Tuttavia, la terapia antibiotica dovrebbe essere considerata dopo l’insuccesso delle prove con antinfiammatori, o nei pazienti con segni di infiammazione sistemica 16, come in caso di invasione e persistenza di batteri nella mucosa intestinale (ad es. colite granulomatosa associata a E. Coli). È possibile che un piccolo sottogruppo di cani con EC non risponda ad alcun altro trattamento, e in questo caso può essere necessaria una somministrazione a lungo termine a dosaggio ridotto al minimo livello efficace.

In alcuni casi di disbiosi, il trapianto di microbiota fecale (FMT) può aiutare a ripristinare il microbiota normale e migliorare i segni clinici 11. La tecnica comporta il trasferimento delle feci da un donatore sano all’intestino di un ricevente tramite l’uso di capsule orali, strumenti endoscopici o un clistere (Figure 5 e 6). Nell’uomo, l’FMT ha un tasso di successo elevato (> 90%) nell’infezione ricorrente da C. difficile infettivo, ma il successo è più limitato nella malattia intestinale infiammatoria, a causa dell’infiammazione intestinale cronica sottostante.

Negli animali l’FMT è ancora una terapia emergente. Il Riquadro 4 mostra un semplice protocollo, ma finora sono state segnalate solo casistiche limitate, dove il successo dipendeva apparentemente dalla patologia sottostante 24. Questa tecnica aiuta a ripristinare il metabolismo degli acidi biliari promuovendo i livelli di C. hiranonis (Figura 7), quindi può essere utile in cani con anomalie nella conversione degli AB e iperproliferazione associata di enteropatogeni, come C. difficile o C. perfringens, e/o negli animali con disbiosi indotta dagli antibiotici e un minor danno sottostante della mucosa intestinale. È stato inoltre dimostrato che migliora i punteggi fecali nei casi di diarrea acuta, quando utilizzato in aggiunta alla terapia antimicrobica standard in cuccioli con infezione da parvovirus, e in cani giovani con diarrea cronica dovuta a infezione confermata da C. difficile 25.

Riquadro 4. Protocollo per l’FMT tramite clistere (basato su 24).

Nei cani con EC, la disbiosi è spesso un effetto secondario dell’infiammazione intestinale e del danno strutturale, e la mancata eradicazione della patologia sottostante comporta la recidiva della disbiosi e dei segni clinici. L’FMT ha quindi un tasso di successo molto variabile nell’EC, e rapporti aneddotici suggeriscono che molti cani con EC avranno punteggi fecali migliorati entro 2-3 giorni dal trattamento, ma recidiveranno e svilupperanno diarrea ricorrente poche settimane dopo. Pertanto, in questi pazienti è necessario modificare l’alimentazione e impostare un’adeguata terapia antinfiammatoria (vedere sopra); l’FMT può essere considerato come trattamento adiuvante nei pazienti che mostrano una risposta subottimale (ad es. feci molli continue) nonostante le terapie standard.

Conclusione

Il microbioma intestinale svolge un ruolo cruciale nella salute dell’ospite e molti animali con patologie gastrointestinali finiscono per sviluppare disbiosi, con conseguente anomalia della funzione microbica che può contribuire ai segni clinici. L’indice di disbiosi è uno strumento diagnostico utile per molti casi, ma poiché ci possono essere varie cause sottostanti, il ripristino del microbiota richiede un approccio terapeutico multimodale e, spesso, a lungo termine.